Indice specialistico Infettivologia

Reazione ligasica Bibliografia Cosa c'è di nuovo in diagnostica batteriologica Reazione ligasica a catena (LRC) per la ricerca di Chlamydia trachomatis La diagnosi di laboratorio di infezione da Chlamydia trachomatis (C.t.) si è recentemente arricchita di un mezzo che, sulla base dei risultati fino ad ora ottenuti, sembra proporsi all'attenzione dei microbiologi e degli infettivologi per la sua sensibilità e specificità: la reazione ligasica a catena (LCR: Ligase Chain Reaction). La LCR proposta per C.t., e che viene presentata in questa sede, è finalizzata alla rilevazione di una corta sequenza, altamente conservata in tutti i sierotipi del microrganismo ma assente in altre specie, localizzata su di un plasmide criptico; questo è presente in circa 10 copie per ogni corpo elementare e reticolare. La reazione (Fig. 1) prevede che il campione, opportunamente trattato per liberare l'eventuale DNA di C.t., venga aggiunto alla miscela di reazione LCR e sottoposto a cicli di riscaldamento e raffreddamento. La miscela di reazione LCR contiene quattro sonde nucleotidiche, presenti in grande eccesso, DNA polimerasi e DNA ligasi termostabili e singoli nucleotidi; le quattro sonde sono in realtà costituite da due coppie di oligonucleotidi capaci di ibridizzare con sequenze bersaglio complementari presenti su singoli filamenti di DNA; inoltre è previsto che ciascuna coppia riconosca sequenze bersaglio separate una dall'altra sullo stesso singolo filamento da un intervallo di alcuni nucleotidi. La DNA polimerasi, utilizzando i nucleotidi forniti nella miscela di reazione, può provvedere a colmare la distanza tra le due sonde; queste, divenute in tal modo adiacenti, possono venire saldate tra loro per opera della DNA ligasi, realizzando un prodotto di amplificazione che a sua volta può essere utilizzato come sequenza bersaglio nei cicli di amplificazione successivi. Attraverso 30-40 cicli è possibile ottenere amplificazioni pari a 10 milioni - 1 miliardo di volte. Ciascuna delle quattro sonde utilizzate nell'amplificazione è opportunamente provvista ad una estremità di uno di due apteni, o un aptene definito di "cattura" o un aptene detto di "rilevamento", in maniera tale che quando le sonde, rilevate le sequenze bersaglio, vengono unite dall'azione della DNA polimerasi, prima, e della DNA ligasi, poi, il prodotto di amplificazione finale è fornito ad una estremità dell'aptene di "cattura" e, all'altra, di quello di "rilevamento". Le sequenze bersaglio amplificate e corredate delle due strutture apteniche, vengono rilevate in un analizzatore automatico attraverso la tecnologia MEIA: Microparticles Enzyme Immuno Assay (Fig. 2); questa prevede la possibilità di "catturare", attraverso anticorpi specifici fissati a microparticelle, le sequenze presentanti i gruppi immunoreattivi (apteni) corrispondenti che in questo caso sono rappresentate dalle sequenze amplificate e dalle sonde con il solo aptene di "cattura" non utilizzate. Successivamente, le microparticelle vengono fissate irreversibilmente ad una matrice di fibra di vetro e attraverso lavaggio vengono allontanate le sonde con il solo aptene di "rilevamento" non utilizzate; il prodotto di amplificazione viene quindi svelato attraverso l'impiego di anticorpi anti-apteni di "rilevamento" coniugati con fosfatasi alcalina. Il coniugato anticorpo-enzima si lega esclusivamente ai prodotti di amplificazione e può essere evidenziato aggiungendo come substrato il 4-metilumbelliferil-fosfato che, defosforilato ad opera della fosfatasi alcalina, si trasforma nel composto fluorescente 4-metilumbelliferone; la velocità di formazione di quest'ultimo è proporzionale alla concentrazione del prodotto di amplificazione. L'impiego del saggio LCR per C.t., attualmente disponibile in commercio, è previsto per campioni endocervicali, uretrali e urinari. Prove analitiche e indagini comparative con altri metodi utilizzati per la diagnosi di laboratorio delle infezioni da C.t., hanno evidenziato (1-9): Una soglia di rilevazione pari o inferiore a 1 UFI (unità formante inclusioni) Una sensibilità media compresa tra il 94,4 e il 100% Una specificità media compresa tra il 99,9 e il 100% Una efficacia pari al 100% Altri vantaggi offerti dal saggio LCR per C.t. sono la possibilità di inattivare automaticamente i prodotti dell'amplificazione al termine delle prove, al fine di ridurre il rischio di contaminazione, ed il costo molto contenuto. Bibliografia -Bassiri, M., et al., 1995, Detection of Chlamydia trachomatis in urine specimens from women by ligase chain reaction, J. Clin. Microbiol., 33, 898-900. -Buimer, M., et al., 1996, Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by ligase chain reaction-based assays with clinical specimens from various sites: implications for diagnostic testing and screening, J. Clin. 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