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Ricerca acidi nucleici
Sensibilità ai farmaci |
Diagnosi convenzionale ed avanzata di laboratorio Malaria d'importazione: ricerca degli acidi nucleici dei plasmodi 
La reazione di amplificazione genica a catena mediante polimerasi (PCR), ha mostrato in questi ultimi anni la sua grande utilità, efficacia e versatilità, quando applicata alla ricerca e messa in evidenza degli acidi nucleici di Plasmodium falciparum (Fig. 4), prima, e degli acidi nucleici degli altri plasmodi (P. vivax, P. ovale, P. malariae), poi (60 - Barker R.H., 1994; 61 - Seesod N., Lundeberg J e coll., 1993; 62 - Kimura M., Miyake H. e coll., 1995; 63 - Singh B., Cox-Singh J. e coll., 1996; 64 - Rachida T., Ringwald P. e coll., 1997; 65 - Edoh D., Steiger S. e coll., 1997). La PCR, che è dotata di elevata sensibilità, nettamente superiore a quella delle procedure convenzionali, è disponibile commercialmente anche in Italia ed è quindi alla portata di tutti i laboratori che intendano avvalersene. La PCR si è rivelata di grande utilità nella differenziazione genetica dei ceppi di plasmodi, nell'identificazione di ceppi farmaco-resistenti e nell'identificazione dei plasmodi nei vettori. Se si dispone dell'organizzazione necessaria per effettuare questo tipo di metodiche di amplificazione, sarà possibile agevolmente risolvere i casi nei quali l'identificazione di specie del plasmodio osservato all'esame microscopico sia incerta e/o dubbia. In questi casi, sarà possibile arrivare ad una corretta identificazione di specie e non sarà necessario seguire il classico consiglio che era quello di considerare il plasmodio in esame che non si riusciva ad identificare come Plasmodium falciparum (66 - N.J. White, 1996). Ricerca dei plasmodi mediante coltura e saggi di sensibilità in vitro
Coltivabilità in vitro di Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum può essere coltivato in vitro anche su "larga scala" (67 - Trager W., Jensen J.B., 1976; 68 - Jensen J.B., Trager W., 1977) e in maniera semiautomatica (69 - Jensen J.B., Trager W., Doherty J., 1979). Recentemente è stato valutato positivamente per la coltura in vitro di Plasmodium falciparum, in sostituzione del classico sistema della candela nella giara di Trager e Jensen, un sistema commerciale capace di generare un ambiente microaerofilo, utilizzato convenzionalmente in molti laboratori per la coltivazione di Campylobacter (70 - Taylor-Robinson A.W. 1998). Determinazione della sensibilità del protozoo ai farmaci antimalarici La coltivabilità in vitro di Plasmodium falciparum è stata opportunamente utilizzata per lo sviluppo di un micrometodo per la determinazione della sensibilità del protozoo ai farmaci antimalarici, sotto l'egida dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (71 - Payne D., Wernsdorfer W.H., 1989). I reagenti necessari per fare questo tipo d'indagine sono disponibili in forma di "kit". Questi sono stati opportunamente standardizzati sotto la direzione dell'OMS, e consentono di determinare la sensibilità di Plasmodium falciparum a diversi farmaci antimalarici (clorochina, meflochina, chinino, amodiachina). La storia dello sviluppo di questo micrometodo dell'OMS, come anche la disponibilità di informazioni sulla sua utilità ed efficacia e di indicazioni sulle modalità da seguire per poterlo avere sono riportate nel lavoro di Payne D. e Wernsdorfer W.H., più sopra citato, cui si rimanda. Considerazioni conclusive Scopo di questa relazione era fare il punto sulla diagnosi di laboratorio dell'infezione da plasmodi della malaria, cercando di valutare se e quali delle procedure di volta in volta sviluppate e proposte in questi ultimi anni siano di fatto significative e concretamente utilizzabili oggi in laboratorio, essendo in grado di rispondere ai criteri di rapidità, semplicità ed efficacia più volte invocati. Se, infatti, l'importanza dell'esame microscopico nella diagnosi di laboratorio dell'infezione da plasmodi non può essere messa in discussione, altrettanto indiscutibile e sentita appare l'opportunità di affiancare all'esame microscopico procedure alternative e/o complementari che siano altrettanto efficaci, ma di minor complessità e possibilmente più facili e rapide. Almeno due procedure ("Parasight-F®" e "ICT malaria P.f.®") con queste caratteristiche d'efficacia, semplicità e rapidità d'esecuzione, lettura dei risultati senza l'aiuto di uno strumento, ma ad occhio nudo, sono disponibili commercialmente anche in Italia e quindi alla portata di tutti i laboratori che intendano avvalersene. Entrambe sono basate sulla ricerca di una proteina (PfHRPII) ricca di istidina, specifica di Plasmodium falciparum, che è presente in campioni di sangue di pazienti infettati con il plasmodio. La loro introduzione nei laboratori che ricevono campioni di sangue di pazienti per i quali sia sospettata un'infezione da plasmodi della malaria può consentire di individuare rapidamente i casi sostenuti da Plasmodium falciparum: vista la semplicità di entrambe le procedure immunocromatografiche, la validità del risultato ottenuto sarà prevedibilmente la medesima sia che si operi durante il consueto orario di lavoro, sia che si operi in situazioni d'emergenza e d'urgenza (durante i turni di guardia, di notte e nei giorni festivi) e/o quando sia operativo personale con scarsa esperienza nell'osservazione microscopica di preparati di sangue colorati con Giemsa per la ricerca e identificazione dei plasmodi della malaria. D'altra parte, se l'indagine microscopica potrà non essere fatta in situazione d'emergenza, proprio grazie all'introduzione di queste procedure immunocromatografiche rapide, e potrà perciò essere rimandata a momenti più opportuni, essa dovrà comunque prima o poi essere effettuata. È infatti opportuno ricordare che l'osservazione microscopica di preparati (strisci di sangue e goccia spessa) per la ricerca dei plasmodi dovrà essere effettuata:
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