Indice specialistico Infettivologia

Indice Questa pagina contiene: Malaria: celebrazioni e anniversari Contributo dei Ricercatori Italiani Malaria: Situazione Mondiale Prevenzione della malaria: Linee Guida Indagine microscopica previa colorazione di Giemsa Sistemi diagnostici alternativi all'esame microscopico Caratteri generali Malaria: celebrazioni e anniversari Sono iniziate nel 1997 e proseguiranno nel corso del 1998 le celebrazioni che la comunità scientifica ha voluto organizzare per ricordare i grandi ricercatori che alla fine dell'ottocento dimostrarono che la malaria veniva trasmessa dalle zanzare. Parasitology Today ha dedicato il numero di agosto 1997 alla malaria e a Ronald Ross che, cento anni fa, nel mese di agosto del 1897, identificò cellule rotondeggianti pigmentate nella parete intestinale di alcune zanzare cui aveva fatto succhiare sangue di un paziente con malaria, scoprendo la fase di moltiplicazione dei parassiti malarici umani nel vettore. La dimostrazione del legame tra i plasmodi della malaria e le zanzare, valse a Ronald Ross il premio Nobel nel 1922 (1 - Parasitology Today, 1997). La Società Italiana di Parassitologia (SOIPA), che ha tenuto il proprio congresso a Roma il 17 - 20 giugno del 1998, ha deciso di dedicare il Simposio Congressuale nella giornata di apertura a: "La malaria ad un secolo dalla scoperta del vettore e a 50 anni dall'interruzione della trasmissione in Italia". Riprendendo le parole del Comitato Organizzatore del XX Congresso SOIPA, si è voluto in questo modo aprire il Congresso con: "..... una sessione plenaria dedicata all'analisi del contributo italiano alla ricerca e al controllo della malaria ad un secolo dalla scoperta del vettore e a 50 anni dall'interruzione della trasmissione dell'infezione nel nostro paese. Nello stesso giorno si concluderanno i lavori di un Convegno sugli archivi italiani di interesse malariologico e verrà inaugurata una mostra documentaria sugli aspetti storici ed attuali di una malattia il cui impatto continua purtroppo ad essere drammatico sopratutto nell'Africa Subsahariana." (2 - Comitato Organizzatore XX Congresso Società Italiana di Parassitologia, 1998). Contributo dei Ricercatori Italiani alla comprensione della malaria Vittorio Puntoni sottolinea in questo modo il fondamentale contributo dei grandi Ricercatori Italiani alla comprensione della malaria. "..... Per la prima volta i parassiti malarici furono osservati nell'uomo da Laveran, il quale tuttavia non interpretò il significato delle varie forme; il ciclo asessuato del parassita, la distinzione in diversi tipi, nonché la riproduzione delle varie forme di malaria sull'uomo, sono problemi risolti per merito di molti italiani e soprattutto con gli studi di Marchiafava, Celli e Golgi. L'importanza delle zanzare nella trasmissione della malaria, già intuita anticamente, fu sostenuta da prima, con argomenti epidemiologici, da Dionisi e da Bignami. In seguito, il Ross, che aveva già studiato la malaria degli uccelli stabilendo ch'essa veniva trasmessa dalla Culex fatigans, osservò che alcune zanzare (da lui non determinate), dopo aver succhiato sangue malarico presentavano nella loro parete intestinale dei corpi rotondeggianti. Tuttavia il ciclo del parassita nelle zanzare, la determinazione delle specie infettanti ed i rapporti fra zanzara ed infezione malarica, furono stabiliti dagli studi italiani, soprattutto da quelli di Grassi, Bignami e Bastianelli." (3 - Vittorio Puntoni, 1959). Ricorre, quest'anno, il centenario della scoperta ad opera di Giovanni Battista Grassi, uno dei grandi malariologi italiani, che la trasmissione dell'infezione malarica è dovuta alle sole zanzare del genere Anopheles. Grassi propose e sostenne fortemente l'equazione "uomo + anofele = malaria" che si rivelerà drammaticamente decisiva nel concretizzare le prospettive di successo nella lotta alla malaria (4 - B. Fantini, 1998). Nel medesimo anno (1898), Amico Bignami dimostrava sperimentalmente la trasmissione della malaria all'uomo tramite puntura con una zanzara Anopheles. Nel complesso, l'insieme delle conoscenze acquisite pose le basi logiche e razionali per attuare efficaci misure di bonifica, impiegare massicciamente il chinino e gli antimalarici di sintesi e procedere con l'applicazione di insetticidi nei locali abitati. Successivamente, grazie all'invenzione del DDT fu possibile realizzare dopo la seconda guerra mondiale la disinfestazione di alcuni territori (5 - M.D. Grmek, J.-Ch. Sournia, 1998). Malaria: situazione mondiale Gli importanti successi per il controllo della malaria ottenuti in Europa nei primi anni settanta hanno fatto pensare alla Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), che fosse ormai diventato possibile attuare una grande campagna di eradicazione di questa parassitosi a livello mondiale. Purtroppo, i risultati sono stati solo parziali e l'OMS ha dovuto constatare il fallimento del piano di eradicazione della malaria, accresciuto dalla dimostrazione della presenza di zanzare anofele resistenti agli insetticidi e della comparsa di plasmodi resistenti ai farmaci antimalarici (5 - M.D. Grmek, J.-Ch. Sournia, 1998). Nel 1997, secondo l'OMS, il problema "malaria" su scala globale è stato serio ed era da considerare in via di peggioramento, analogamente a quanto osservato nel 1996 (6 - WHO, 1998). Questi sono alcuni significativi dati sulla malaria stimati e forniti dall'OMS per il 1997, aggiornati al febbraio 1998: più del 40% della popolazione mondiale vive in aree dove è presente il rischio di contrarre la malaria; il rischio di contrarre la malaria è presente in 100 differenti regioni; in 92 di queste è presente e può essere trasmesso Plasmodium falciparum, responsabile della forma grave di malaria; 1,5-2,7 milioni di persone sono i morti di malaria ogni anno, e approssimativamente un milione di decessi tra i bambini con meno di cinque anni di vita è da attribuire alla sola malaria o alla malaria in presenza di altre malattie; le nazioni dell'Africa Tropicale pagano il pesante fardello di avere più del 90% dell'incidenza dei casi totali di malaria ed il numero maggiore dei casi di morte per malaria; Plasmodium falciparum è la specie di plasmodio predominante in Africa Tropicale, Amazzonia, Asia del Sud-Est e Oceania, mentre è meno comune nel resto del mondo; la trasmissione della malaria è stata reintrodotta in Asia centrale e nel Caucaso, facilitata da gravi problemi socio-economici e dal collasso dei servizi socio-sanitari. (6 - WHO, 1998). Linee guida per la prevenzione della malaria in Italia. Importanza della indagine microscopica previa colorazione di Giemsa per la ricerca dei plasmodi della malaria Il Ministero della Sanità, Dipartimento Prevenzione, Ufficio III - Malattie Infettive, ha diramato l'11 novembre 1997 la circolare n. 14 contenente: "Linee guida per la prevenzione della malaria" (7 - Ministero della Sanità, 1997). Utile appare ai fini della presente trattazione, valutare quanto la circolare indica sulle procedure da utilizzare per porre diagnosi di laboratorio di malaria. Le informazioni fornite possono essere così sintetizzate: per porre diagnosi di malaria deve essere preparato uno striscio di sangue prelevato tramite puntura del polpastrello di un dito; lo striscio deve essere fissato con metanolo e colorato con Giemsa al 3% (pH 7,2) per 30 - 45 minuti; la goccia spessa è colorata senza che venga fissata; nelle infezioni da Plasmodium falciparum, la parassitemia deve essere stimata contando la percentuale di emazie parassitate, non il numero dei parassiti; la goccia spessa è più sensibile dello striscio sottile poiché permette di esaminare una maggiore quantità di sangue, ma la sua lettura è più difficoltosa; i laboratori con limitata esperienza possono preferire l'esame microscopico dello striscio sottile e non analizzare la goccia spessa per le ragioni esposte al punto precedente; nei casi di pazienti con sospetto clinico per malaria e con ricerca microscopica negativa è necessario per escludere l'infezione da plasmodi, effettuare ulteriori ricerche del parassita su strisci di sangue allestiti con campioni di sangue prelevati approssimativamente ogni 12 - 24 ore per 3 giorni consecutivi. In conclusione, la diagnosi di laboratorio di infezione da plasmodi della malaria viene basata sulla ricerca degli stadi del parassita mediante esame microscopico di opportuni preparati di campioni di sangue (vetrini contenenti strisci sottili e preparati con goccia spessa colorati con Giemsa) ottenuti da individui con sospetta infezione. Utilità dell'indagine microscopica previa colorazione di Giemsa per la ricerca dei plasmodi della malaria In effetti, punti di forza dell'indagine microscopica previa colorazione di Giemsa per la ricerca dei plasmodi della malaria sono: semplicità operativa delle fasi di prelievo del campione di sangue da esaminare; rapidità nelle fasi di preparazione e colorazione dei vetrini per l'esame microscopico; possibilità di identificare i plasmodi osservati differenziandoli a livello di specie (Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax); possibilità di riconoscere i differenti stadi dei plasmodi osservati (trofozoiti, schizonti, gametociti); possibilità di valutare la parassitemia, fornendo un importante elemento di giudizio avente implicazioni terapeutiche e prognostiche; possibilità di valutare la presenza del pigmento malarico; possibilità di fornire rapidamente il risultato; basso costo dell'indagine. Per tutte queste ragioni, riassumibili nella grande efficacia da tutti riconosciuta all'indagine microscopica nella diagnosi di laboratorio della infezione da plasmodi della malaria, questo tipo di indagine ha resistito inossidabile al passare degli anni e alla presentazione di differenti tipi di indagine, di volta in volta proposti. In tabella 1 è riportato, a scopo esemplificativo, quanto indicato per la ricerca di parassiti malarici nell'uomo mediante esame microscopico previa colorazione di Giemsa, da V. Puntoni nel 1959 (8 - V. Puntoni, 1959, pg. 904 - 906), e trentasette anni dopo, nel 1996, da D.C. Warhurst e J.E. Williams (9 - D.C. Warhurst e J.E. Williams, 1996). Tabella 1. Ricerca dei parassiti malarici nell'uomo mediante esame microscopico previa colorazione di Giemsa secondo V. Puntoni (1959) e D.C. Warhurst e J.E. Williams, (1996). Fase V. Puntoni, 1959 Warhurst e Williams, 1996 Prelievo Materiale da esaminare Sangue periferico ottenuto dal polpastrello delle dita, dal lobulo dell'orecchio. Sangue periferico ottenuto dal polpastrello delle dita, dal lobulo dell'orecchio. Biopsia midollare, se disponibile. Se necessario utilizzare EDTA come anticoagulante. Quando fare il prelievo Inizio del brivido nella quartana e terzana primaverile (è più facile osservare forme che facilitano la diagnosi); nell'intervallo degli accessi febbrili nella terzana maligna (la schizogonia avviene negli organi). Durante o dopo l'accesso febbrile, prima dell'inizio della terapia. Esame microscopico previa colorazione Striscio sottile: Sangue disteso in monostrato su vetrino portaoggetto, essiccato, fissato, colorato con Giemsa. Osservazione obiettivo ad immersione. Sangue disteso in monostrato su vetrino portaoggetto, essiccato, fissato, colorato con Giemsa. Osservazione obiettivo ad immersione. Goccia spessa Più goccie di sangue raccolte su vetrino, essiccate, deemoglobinizzate, fissate con metanolo, colorate con Giemsa. Secondo Missiroli: immergere il preparato seccato, non fissato, nel Giemsa diluito, che deemoglobinizza e colora al tempo stesso. Utile quando i parassiti sono scarsi, proposto per la prima volta dal Ross. Goccia di sangue raccolta su vetrino, essiccata, non fissata, deemoglobinizzata, colorata con Giemsa diluito. Affidabilità dell'indagine microscopica previa colorazione di Giemsa per la ricerca dei plasmodi della malaria La riproducibilità dei risultati ottenuti nella ricerca dei parassiti malarici mediante esame microscopico previa colorazione con Giemsa è strettamente legata e condizionata: dalla preparazione del personale preposto all'allestimento e colorazione degli strisci sottili e dei preparati a goccia spessa e alla lettura di questi preparati al microscopio; dall'osservazione scrupolosa di quanto previsto in un opportuno protocollo operativo in uso nel laboratorio contenente tutte le informazioni necessarie per effettuare l'indagine; dalla presenza nei campioni di sangue dei pazienti in esame di un numero adeguato di stadi dei plasmodi responsabili dell'infezione. Validità dell'indagine microscopica previa colorazione di Giemsa per la ricerca dei plasmodi della malaria In effetti, diversi Autori hanno segnalato che l'indagine microscopica per la ricerca dei plasmodi della malaria si rivela nella pratica attività di alcuni laboratori non sempre molto efficace, per varie cause e differenti fattori quali: impreparazione del personale preposto all'indagine; non osservazione dei protocolli diagnostici e/o loro indisponibilità in laboratorio; presenza in alcuni dei campioni di sangue dei pazienti in esame, di un numero scarso di parassiti; difficoltà nell'identificare i plasmodi sia nei casi di infezione con presenza di una singola specie sia nelle infezioni miste con contemporanea presenza di due specie di plasmodi. Validità dell'indagine microscopica previa colorazione di Giemsa per la ricerca dei plasmodi della malaria: esperienza in Inghilterra Questi aspetti sono stati valutati, in Inghilterra, nel 1992 da Milne e coll. dopo che nel 1991 erano stati segnalati 2332 casi di malaria di importazione ed erano stati osservati 12 decessi, 11 dei quali causati da Plasmodium falciparum (10 - LM Milne e coll, 1994). Lo studio, durato 3 mesi, ha preso in esame gli strisci di sangue inviati dai laboratori inglesi per la conferma di malaria al Laboratorio di Riferimento per la Malaria, Scuola Londinese di Igiene e Medicina Tropicale e al Dipartimento di Parassitologia, Ospedale per le Malattie Tropicali di Londra. Questi in sintesi i risultati ottenuti: 112 pazienti avevano un'infezione da P. falciparum che è stata correttamente identificata nel 75,9% dei casi, e incorrettamente e/o incompletamente diagnosticata nei restanti 24,1%; 94 pazienti avevano un'infezione da P. vivax che è stata correttamente identificata nel 62,8% dei casi, e incorrettamente e/o incompletamente diagnosticata nei restanti 37,2%; 17 pazienti avevano un'infezione da P. ovale che è stata correttamente identificata nel 29,4% dei casi, e incorrettamente e/o incompletamente diagnosticata nei restanti 70,6%; 4 pazienti avevano un'infezione da P. malariae che è stata correttamente identificata nel 35,3% dei casi, e incorrettamente e/o incompletamente diagnosticata nei restanti 64,7%; 6 pazienti avevano un'infezione mista che è stata correttamente identificata in un solo caso; 4 pazienti non avevano un'infezione da plasmodi. Questo è stato correttamente osservato nel 61,8% dei casi, mentre parassiti (P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, Plasmodium sp.) sono stati non correttamente osservati nel 32,4% dei casi. Validità dell'indagine microscopica previa colorazione di Giemsa per la ricerca dei plasmodi della malaria: esperienza in Italia G. Sabatinelli e F. D'Ancona hanno analizzato i 668 casi di malaria notificati in Italia nel 1993, anno in cui si sono osservati 4 decessi per malaria (11 - G. Sabatinelli e F. D'Ancona, 1994) . Questi in sintesi i risultati ottenuti: la corretta identificazione della specie di plasmodio presente nello striscio di sangue esaminato è stata correttamente effettuata nell'80,7 % dei casi; l'identificazione della specie di plasmodio presente nello striscio di sangue esaminato non è stata correttamente effettuata nell'8,7 % dei casi; l'identificazione della specie di plasmodio presente nello striscio di sangue esaminato è stata omessa nel 10,7 % dei casi; in 32 casi, il vetrino non è stato allegato alla denuncia. Necessità di disporre di nuovi sistemi diagnostici alternativi all'esame microscopico La constazione più volte fatta, autorevolmente, della a "volte" non buona qualità e della a "volte" scarsa affidabilità dell'indagine microscopica nella diagnosi di laboratorio dell'infezione da plasmodi della malaria, ha indotto diversi esperti a sottolineare la necessità urgente di disporre di nuovi sistemi diagnostici alternativi all'esame microscopico (12 - World Health Organization, 1988). Che la diagnosi di laboratorio della malaria necessiti di nuove procedure, rapide, semplici ed efficaci è un concetto che è stato ribadito anche recentemente (13 - Beadle e coll., 1994). Scopo di questa relazione è fare il punto sulla diagnosi di laboratorio dell'infezione da plasmodi della malaria, cercando di valutare se alcune delle procedure di volta in volta sviluppate e proposte in questi ultimi anni siano di fatto significative e concretamente utilizzabili oggi in laboratorio, essendo in grado di rispondere ai criteri di rapidità, semplicità ed efficacia più volte invocati.